RIP技术（RNA结合蛋白免疫沉淀）
RIP技术（RNA结合蛋白免疫沉淀）
RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀），是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术。分析与目的蛋白结合的RNA.运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析；即用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白，防止非特异性的RNA的结合，免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来，结合的RNA序列可通过microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或 高通量测序（RIP-Seq）方法来鉴定。是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助我们发现miRNA的调节靶点。
RIP实验流程：
（一）细胞裂解液获取
A. 单层细胞或者贴壁细胞处理
1. 冷PBS清洗培养皿或培养瓶中的细胞两次。
2. 加入冷PBS后用细胞刮将细胞刮下来，收集至enpendoff管。
3. 1500rpm，4℃离心5min，弃上清，收集细胞。
4. 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，吹打均匀后于冰上静置5min。
5. 每管分装200ul细胞裂解液，贮存于-80℃。
B. 悬浮细胞处理：先收集细胞再计数，然后清洗裂解
C. 组织样品处理
1. 冷PBS清洗新鲜切下的组织三次。
2. 加入冷PBS后，用匀浆器或其他细胞分离设备使组织分散为单个细胞，计数。
3. 1500rpm，4℃离心5min，弃上清，收集细胞。
4. 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，吹打均匀后置于冰上静置5min。
5. 每管分装200ul细胞裂解液，贮存于-80℃。
（二）磁珠的准备
A. 实验前准备
1. enpendoff管
2. 磁力架
3. 冰盒，RIP Wash Buffer置于冰上
4. 抗体，置于冰上
5. 涡旋震荡器
6. 枪、枪头放于超净台照射30min，枪喷DEPC水
B. 磁珠准备过程
1. 重悬磁珠。
2. 标记实验所需的enpendoff管，样品包括目的样品，阴性对照与阳性对照。
3. 吸取50ul 重悬后的磁珠悬液于每个enpendoff管。
4. 每管加入500ul RIP Wash Buffer，涡旋震荡。
5. 将enpendoff管置于磁力架上，并左右转动15°使磁珠吸附成一条直线，去上清，重复一次。
6. 用100ul的RIP Wash Buffer重悬磁珠，加入约5ug相应抗体于每个样品中。
7. 室温孵育30min。
8. 将enpendoff管置于磁力架上，弃上清。
9. 加入500ul RIP Wash Buffer，涡旋震荡后弃上清，重复一次。
10. 加入500ul RIP Wash Buffer，涡旋震荡后置于冰上。
（三）RNA结合蛋白免疫沉淀
A. 准备工作
1. 冰盒
2. 360°旋转仪
3. RIP Wash Buffer 、0.5M EDTA 、RNase Inhibitor 置于冰上
B. RNA结合蛋白免疫沉淀实验过程
1. 准备RIP Immunoprecipitation Buffer。
2. 将前上步的enpendoff管放磁力架上，去上清，每管加入900ul RIP Immunoprecipitation Buffer。
3. 迅速解冻第一步制备的细胞裂解液，14,000rpm，4℃离心10min。吸取100ul上清液于上一步的磁珠-抗体复合物中，使得总体积为1ml。
4. 4℃孵育3h至过夜。
5. 短暂离心，将enpendoff管放在磁力架上，弃上清。
6. 加入500ul RIP Wash Buffer，涡旋震荡后将enpendoff管放在磁力架上，弃上清，重复清洗6次。
（四）RNA纯化
A. 实验前准备
1. 枪、枪头、enpendoff管紫外照射30min，喷DEPC水以除RNA酶
2. Salt SolutionⅠ、Salt SolutionⅡ、RIP Wash Buffer、Proteinase K、10%SDS、 Precipitate Enhancer 置于冰上
3. RNase-free的乙醇、氯仿、异戊醇
4. DEPC水置于冰上
5. 离心机预冷
6. 冰盒
B. RNA纯化过程
1. 准备Proteinase K Buffer。每个样品需150ul。
2. 用150ul Proteinase K Buffer重悬上述磁珠-抗体复合物。
3. 55℃孵育30min。
4. 孵育完之后，将enpendoff管置于磁力架上，将上清液吸入一新的enpendoff管中。
5. 于每管上清液中加入250ulRIP Wash Buffer。
6. 于每管加入400ul苯酚：氯仿：异戊醇，涡旋震荡15s，室温下14,000rpm离心10min。
7. 小心的吸取350ul上层水相，吸入另一新的enpendoff管。
8. 于每管加入400ul氯仿，涡旋震荡15s，室温下14,000rpm离心10min。
9. 小心的吸取300ul上层水相，吸入另一新的enpendoff管。
10. 每管加入50ul Salt SolutionⅠ，15ul Salt SolutionⅡ,5ul Precipitate Enhancer ，850ul 无水乙醇(无RNase)，混合，-80℃保持1h至过夜。
11. 14,000rpm，4℃离心30min，小心去上清。
12. 用80%乙醇冲洗一次，14,000rpm，4℃离心15min，小心去上清，空气中晾干。
13. 10-20ul DEPC水溶解，-80℃保存，送测序或进行下游实验。
