EMSA

实验介绍

【技术原理及背景】

研究启动子结合蛋白的经典方法，是一种用于定性和定量分析核酸蛋白相互作用的技术，其基本原理是末端标记的核酸探针可以与蛋白质结合，电泳时这种复合物相对没有结合蛋白的探针在凝胶中移动的速度慢，即表现为相对滞后。该方法不仅简单迅速且灵敏度高；另一方面它可以用竞争性试验来评价蛋白和核酸结合的特性。目前用于检测DNA结合蛋白、RNA结合蛋白，并可通过加入特异性抗体来检测特定的蛋白质，结合蛋白双向电泳及质谱技术进行未知蛋白的鉴定分析。

【技术应用】

1. 用于检测某一特定的DNA或RNA序列与某一个特定的蛋白质之间是否存在相互作用关系。

2. 用于验证预测结合的核苷酸序列。

【实验原理】

案例展示

实验优缺点

优势：

1. 可用目的蛋白的重组蛋白与DNA或RNA探针进行验证，避免非常规物种缺少抗体的困扰。

2. 是用于验证反式作用因子（如转录因子）与正式作用元件（如启动子）结合的经典技术。

3. 可定义核酸序列与蛋白质的直接互作关系。

4. 可分析结合位点（设计野生型及突变型探针）。

不足：
1. 探针为人工合成，无法完全模拟特定生理状态下的结合。

2. 如果是用于检测转录因子活性，无法判断结合启动子后对靶基因的转录活性。

3. 必须已知DNA或RNA序列，才能设计探针。

送检及交付标准

样品类型	样品需求	保存条件	运输条件	备注
动物组织	单个样品>0.1g，2mlEP管或冻存管装，不要过量；样本应尽量新鲜，如不能立即提取蛋白或核酸，应液氮速冻后冻存于-80℃或更低，冻存样本避免反复冻融以致降解	-80℃	干冰	所有样本均须有唯一标记，且标记清晰可识
种子样本	去壳新鲜或保存于液氮中的的种子样本，单个样品>0.2g。	-80℃	干冰
贴壁/悬浮细胞	1. 总RNA或蛋白：10⁶cell/指标、浆/核RNA或蛋白：10⁷cell/指标、线粒体RNA或蛋白：2*10⁷ cell/指标，样本尽量新鲜，细胞收取后直接加Trizol（QPCR检测）或直接冻存于-80℃ 2. 若细胞处理（加药、转染、感染）后状态差应酌情加大收样量	-80℃	干冰
全血/血清样品	用抗凝管保存的外周血 5~10ml，骨髓 1~3ml； -80℃保存不超半周的白细胞匀浆>400μl，每 400μl 加入 400μl Trizol。	-80℃	干冰
石蜡包埋样品	由标准的石蜡包埋盒包埋的石蜡块，有效厚度大于 0.1cm；新鲜的 FFPE 组织切片，每片厚度不超过 10μm，2~8 张，表面积不超过 250mm2。	-20℃	冰袋
抗体	1. 按样本种属提供满足相应实验要求的抗体； 2. 按抗体说明书要求寄送，尽量避免分装；如分装，确保量足够进行实验，并提供抗体说明书。 3.保存抗体的抗体管上应有能够识别此抗体的标记，抗体的量应大于实验所需的量。	-20℃	冰袋
引物	干粉，≥1OD，如进行预实验，每个基因至少提供两对引物，附带公司引物合成单。	-20℃	冰袋或常温

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