RIP检测

实验介绍

【应用简介】

核酸和蛋白质是组成生命的主要物质，研究细胞内RNA与蛋白结合情况，可以了解转录后调控网络的动态过程，帮助我们发现的miRNA的调节靶点，RIP检测实验是应用于蛋白与RNA互作关系的重要参考。

【技术原理图】

【实验方法】

第一步：细胞裂解液的制备

第二步：磁珠与抗体的准备

第三步：RNA结合蛋白免疫沉淀

第四步：用蛋白酶ķ对RNA-蛋白复合物进行消化

第五步：RNA纯化

第六步：对结合在复合物上的RNA反转录，合成cDNA

第七步：Q-PCR验证RNA

案例展示

技术总结

【常见问题】

1、经过免疫沉淀后的RNA浓度过低；

2、Input组目的条带无扩增；

3、RNA纯度未在1.8-2.1之间；

4、阴性对照IgG反应中有目的条带。

【注意事项】

1、RIP反应体系中的试剂和抗体中均需保证无RNA酶；

2、细胞样本的数量较大，应按照所需要求提供细胞样本数量；

3、选购的相应的抗体应达到IP实验级别，并通过阴性实验反馈结果可信性。

送检与交付标准

样品类型	样品需求	保存条件	运输条件	备注
动物组织	单个样品>0.1g，2mlEP管或冻存管装，不要过量；样本应尽量新鲜，如不能立即提取蛋白或核酸，应液氮速冻后冻存于-80℃或更低，冻存样本避免反复冻融以致降解	-80℃	干冰	所有样本均须有唯一标记，且标记清晰可识
种子样本	去壳新鲜或保存于液氮中的的种子样本，单个样品>0.2g。	-80℃	干冰
贴壁/悬浮细胞	1. 总RNA或蛋白：10⁶cell/指标、浆/核RNA或蛋白：10⁷cell/指标、线粒体RNA或蛋白：2*10⁷ cell/指标，样本尽量新鲜，细胞收取后直接加Trizol（QPCR检测）或直接冻存于-80℃ 2. 若细胞处理（加药、转染、感染）后状态差应酌情加大收样量	-80℃	干冰
全血/血清样品	用抗凝管保存的外周血 5~10ml，骨髓 1~3ml； -80℃保存不超半周的白细胞匀浆>400μl，每 400μl 加入 400μl Trizol。	-80℃	干冰
石蜡包埋样品	由标准的石蜡包埋盒包埋的石蜡块，有效厚度大于 0.1cm；新鲜的 FFPE 组织切片，每片厚度不超过 10μm，2~8 张，表面积不超过 250mm2。	-20℃	冰袋
抗体	1. 按样本种属提供满足相应实验要求的抗体； 2. 按抗体说明书要求寄送，尽量避免分装；如分装，确保量足够进行实验，并提供抗体说明书。 3.保存抗体的抗体管上应有能够识别此抗体的标记，抗体的量应大于实验所需的量。	-20℃	冰袋
引物	干粉，≥1OD，如进行预实验，每个基因至少提供两对引物，附带公司引物合成单。	-20℃	冰袋或常温

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