腺相关病毒

 

腺相关病毒（Adeno-associated virus）属于细小病毒科，Dependoparvovirus属，是目前发现的一类结构简单、无包膜的单链DNA缺陷型病毒，它的生命周期依赖于复制病毒的参与，如腺病毒和单纯疱疹病毒。野生型的腺相关病毒可以定点整合到人类第19号染色体的AAVS1位点，而重组腺相关病毒由于缺少整合和复制必需的两个基因而无法整合。因此，重组腺相关病毒主要以游离于染色体的附加体形式存在，并可长时间存在于非分裂细胞中。另外，腺相关病毒具有高组织特异性、良好的扩散性、低免疫原性、高安全性和稳定性。基于以上特点，重组腺相关病毒已经成为科研和基因治疗中具市场前景的病毒载体之一。

*如您对上述服务感兴趣，请您按网页最下方联系方式联系，我们将为您提供具体实验方案和项目价格。

 

 

不同组织对应血清型：

腺相关病毒/AAV血清型

现阶段研究人员已发现12种人类AAV 血清型（AAV1至AAV12）和 100多种非人类灵长动物AAV血清型。不同AAV血清型具有不同的衣壳蛋白空间结构、序列和组织特异性，因而其识别与结合的细胞表面受体也相应有很大差别，这也导致不同血清型转染的组织类型、细胞类型和感染效率也各不相同。表一是人类AAV1至AAV9识别的细胞表面受体；表二是AAV1至AAV9的不同组织亲噬性。

 

 

Tissue	Optimal Serotype
CNS	AAV1，AAV2，AAV4，AAV5，AAV8，AAV9
Heart	AAV1，AAV8，AAV9
Kidney	AAV2
Liver	AAV7，AAV8，AAV9
Lung	AAV4，AAV5，AAV6，AAV9
Pancreas	AAV8
Photoreceptor Cells	AAV2，AAV5，AAV8
RPE(Retinal Pigment Epithelium)	AAV1，AAV2，AAV4，AAV5，AAV8
Skeletal Muscle	AAV1，AAV6，AAV7，AAV8，AAV9

 

 

                                                     

腺相关病毒/AAV包装流程

维真生物可以提供从腺相关病毒/AAV质粒设计、构建、包装至表达分析的全套服务。不仅如此，维真生物也可以提供全面的腺相关病毒/AAV载体和表达系统，用于体内和体外表达human/mouse/rat ORFs，lncRNA、circRNA、shRNAs和CRISPR/gRNA。维真生物生产的腺相关病毒/AAV具有滴度高、纯度高和稳定性高的三高优点。下面是腺相关病毒/AAV从头合成的流程：

 

 

腺相关病毒/AAV纯化

维真生物采用碘克沙醇密度梯度超速离心法对AAV病毒进行纯化。碘克沙醇是一种造影剂，已接受了临床检验。它具有非离子型、对细胞无毒和代谢惰性等优点。现在在病毒纯化方面应用广泛。它利用不同颗粒之间存在的沉降系数差，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带。下图是AAV病毒纯化前后的示意图：

 

 

 

 

腺相关病毒/AAV滴度检测

 

 

 

 

维真生物的AAV病毒是通过用QPCR的方法来检测的病毒滴度，得到的结果为包装得到的病毒颗粒数。其原理是用腺相关病毒基因组特异性引物进行实时定量PCR。在定量曲线的线性范围内，Ct值与已知拷贝数质粒的Ct值的比值即为病毒基因组的初始拷贝数。下面是AAV-GFP滴度的检测结果：

 

 

腺相关病毒/AAV纯度检测

 

 

 

 

维真生物的AAV纯度通过灵敏的银染方法进行检测。AAV衣壳蛋白含有3种亚基VP1（82kDa）、VP2（72kDa）、VP3（62kDa），且所占比例为VP1：VP2：VP3=1:1:10。因此，一个纯度高的AAV在SDS-PAGE分析时仅显示三条带。下图是纯化后AAVs的银染结果：

 

 

 

 

服务特色：

 

1. 载体全：	近30多种组织特异性启动子和多种报告基因可供客户选择。
2. 货期短：	AAV克隆载体均与我们18,000个预制人源ORF cDNA克隆MCS区通用，行业中生产周期短；
3. 滴度高：	可提供1012V.G/ml及以上滴度的病毒.可高达1014V.G/ml；
4. 服务优：	可根据客户具体实验，由公司专业技术人员提供载体构建方案，提供特殊定制服务。

 

 

相关问题解答：

1. AAV 和重组rAAV的区别？

腺相关病毒（AAV）属于微小病毒科，是一类小的、二十面体、无包膜病毒。1965年，AAV发现于腺病毒制备物中，并由此得名。AAV是一种复制缺陷性病毒，其复制依赖于其他辅助病毒，如腺病毒和疱疹病毒。AAV不编码自己的聚合酶，因此其复制过程依赖于宿主细胞的聚合酶活性。

重组AAV（rAAV）是人工改造的AAV，没有编码AAV病毒复制和结构蛋白的rep和cap基因。rAAV中与复制和包装相关的rep和cap 基因被替换为ITRs间的基因表达框，这使rAAV具有约4.7 kb的包装容量。

 

2. 使用AAV有哪些生物安全性要求 ?

可在生物安全1级（BSL-1）实验室操作生产无辅助病毒和编码非致癌基因的重组AAV。另外，应在生物安全2级（BSL-2）实验室封闭处理具有生物危害性的材料。

 

3. 重组AAV 安全吗 ?

迄今为止，未发现野生型AAV有致病性。野生型AAV，在无需辅助病毒（如腺病毒）的存在下，复制效率非常低。重组腺相关病毒（rAAV）由多个质粒（cis质粒、辅助质粒、rep/Cap质粒）组成。Cis质粒、辅助质粒与rep/Cap质粒之间不具有同源性序列，因此重组AAV在理论上不具有复制的能力。

 

4. 重组AAVs的克隆容量有多大?

AAV具有〜4.7Kb的包装能力。2个ITR之间插入的DNA长度接近允许的最大值4.7Kb时，包装效率显著降低。例如，对于过表达来自cDNA的基因，CMV-poly（A）信号元件约为1KB，因此最大可包装的cDNA长度约为3.2kb，如果共表达GFP（约0.8kb），则可包装的容量大约为2.4kb。

 

 

 

 

 

 

 

 

5. 哪些血清型的AAV可供选择？

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

目前为您提供的AAV 血清型为AAV1，AAV2，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8 &，AAV9，AAV rh10，AAV retro，AAV ANC80，AAV DJ & AAV DJ-8，AAV PhpB & AAV PhpeB，AAV 7m8和AAV shh10等。

 

6. 使用重组腺相关病毒rAAV递送基因的优势是什么 ?

 

 

 

rAAV病毒滴度高，可感染分裂和非分裂细胞、免疫原性小、体内表达外源基因时间长。

 

7. AAV载体稳定吗? 如何保存AAV载体 ?

 

纯化的AAV载体在4℃或更低温度下高度稳定。建议您将AAV分装后，-80℃下长期保存。

 

8. 订制AAV服务，客户需要提供哪些材料? 客户收到的产品是怎样的 ?

 

您可以从我们的人源ORF cDNA库中挑选，或者提供您的质粒DNA或DNA序列，我们将基因克隆至AAV载体。您还可以指定特定的融合标签和AAV血清型。

基因沉默服务，请您提供已验证的shRNA序列以构建重组rAAV载体。我们的标准载体具有U6启动子和GFP标记。

通常情况下，可为客户提供500 ul病毒液1×10^13 VP/ml。也可根据客户的需要，提供特定规格的产品。

 

9. 慢病毒、腺病毒、腺相关病毒三种病毒有什么区别？如何选择？

 

对于转染困难的细胞，科研工作者通常会选择病毒来导入目的基因。目前，腺病毒、慢病毒和腺相关病毒是常用的病毒载体工具。那么如何选择适合您实验体系的病毒工具，请参考下面3种病毒工具的比较：