CHIP检测

实验介绍

【应用简介】

核酸和蛋白质是组成生命的主要生物大分子，两者的相互作用是构成生命活动的生长、繁殖、运动、遗传和代谢等生命活动的基础。研究蛋白质和核酸间的相互作用是人们探索生命现象奥秘的关键，ChIP检测实验是应用于蛋白与核酸互作关系的重要参考。

【实验原理】

CHIP实验在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

【实验方法】

Step1：细胞培养物交联和样品制备

Step2：胞核制备和染色质消化

Step3：染色质消化和浓度分析

Step4：染色质免疫沉淀法

Step5：将染色质从抗体/Protein G Magnetic Beads上洗脱下来并解交联

Step6：使用离心柱纯化 DNA

Step7：用 PCR定量 DNA

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案例展示

【结果分析】

1、阳性对照组条带清晰无杂带，阴性对照组正常，表明CHIP实验结果可信，操作合格；

2、Input组条带清晰可见，表明PCR扩增引物可用于该指标的检测；

3、样本组1和样本组2中检测XX蛋白组均有条带，表明该研究的基因的启动子区和XX蛋白可发生结合。

【结果分析】

1、阳性对照组条带清晰无杂带，阴性对照组正常，表明CHIP实验结果可信，操作合格；

2、Input组条带清晰可见，表明PCR扩增引物可用于该指标的检测；

3、样本组中检测XX蛋白组无条带，表明该研究的基因的启动子区不可以和XX蛋白发生结合。

技术总结

【常见问题】

1、消化的染色质浓度过低。

2、染色质消化不足且片段过大（大于900 bp）。

3、样品输入对照组PCR反应中无产物或产物很少。

4、阳性对照组蛋白H3-IP RPL30 PCR反应中无产物。

5、阴性对照 Rabbit IgG-IP 和阳性对照 Histone H3-IP PCR 反应中产物的数量相等。

【注意事项】

1、ChIP实验要求必须是新鲜的组织或活细胞，一次实验需至少需要150 mg新鲜的组织或2x10⁷个细胞，如不能提供新鲜的组织或活细胞，请联系客服，获得预处理方法；

2、部分抗体级别可能达不到ChIP级别的要求，需要采购对应级别的抗体并通过阴阳性实验反馈结果可信性；

3、ChIP对照：现有阳性对照H3和阴性对照IgG；

4、采用CST品牌的SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads)试剂盒用于本实验。

送检与交付标准

样品类型	样品需求	保存条件	运输条件	备注
动物组织	单个样品>0.1g，2mlEP管或冻存管装，不要过量；样本应尽量新鲜，如不能立即提取蛋白或核酸，应液氮速冻后冻存于-80℃或更低，冻存样本避免反复冻融以致降解	-80℃	干冰	所有样本均须有唯一标记，且标记清晰可识
种子样本	去壳新鲜或保存于液氮中的的种子样本，单个样品>0.2g。	-80℃	干冰
贴壁/悬浮细胞	1. 总RNA或蛋白：10⁶cell/指标、浆/核RNA或蛋白：10⁷cell/指标、线粒体RNA或蛋白：2*10⁷ cell/指标，样本尽量新鲜，细胞收取后直接加Trizol（QPCR检测）或直接冻存于-80℃ 2. 若细胞处理（加药、转染、感染）后状态差应酌情加大收样量	-80℃	干冰
全血/血清样品	用抗凝管保存的外周血 5~10ml，骨髓 1~3ml； -80℃保存不超半周的白细胞匀浆>400μl，每 400μl 加入 400μl Trizol。	-80℃	干冰
石蜡包埋样品	由标准的石蜡包埋盒包埋的石蜡块，有效厚度大于 0.1cm；新鲜的 FFPE 组织切片，每片厚度不超过 10μm，2~8 张，表面积不超过 250mm2。	-20℃	冰袋
抗体	1. 按样本种属提供满足相应实验要求的抗体； 2. 按抗体说明书要求寄送，尽量避免分装；如分装，确保量足够进行实验，并提供抗体说明书。 3.保存抗体的抗体管上应有能够识别此抗体的标记，抗体的量应大于实验所需的量。	-20℃	冰袋
引物	干粉，≥1OD，如进行预实验，每个基因至少提供两对引物，附带公司引物合成单。	-20℃	冰袋或常温

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