co-IP免疫共沉淀/(Co-IP-WB/Co-IP-MS)

实验介绍

【实验介绍】

Co-IP主要用于检测蛋白质与蛋白质之间相互作用，是IP实验的一种扩展，基于IP反应的潜力，在样品溶液中捕获和纯化主要目标（抗原等）及通过天然相互作用靶标结合的其他的大分子。此外，还可以利用Co-IP来确定在不同条件下的蛋白质相互作用。
CO-IP的应用场景主要是：
1、用于研究蛋白质复合体成分（通过IP级抗体直接捕获目的蛋白族群，或通过构建带标签的目的蛋白融合表达载体并通过标签蛋白的IP抗体进行免疫捕获。常与western blot和蛋白质谱联用进行IP产物分析）。

2、用于检测生理状态下存在的蛋白质互作关系。

3、用于检测蛋白质的修饰状态，如泛素化。

【技术原理】

免疫共沉淀是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的Protein G或A能特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的方法。其基本原理是在细胞裂解液中加入感兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于磁珠的Protein G或A，若细胞中存在与兴趣蛋白相结合的目的蛋白，就可以形成蛋白复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—Protein G或A”；最后通过免疫印迹实验来检测目的蛋白。

【实验流程】

CO-IP实验流程图.png

案例展示

技术总结

【技术总结】

1、实验样品制备方法准备：很重要！根据研究目的，检测样品可能是组织样品，也可能是细胞样品，不同样品制备流程不太相同，目的蛋白表达量也有较大差别，必须选择合适的样品和样品制备方法。

2、根据研究目的选择适合的蛋白特异性抗体：非常重要！用于Co-IP实验的抗体是针对目的蛋白的特异性抗体，最理想的是选择一种能识别兴趣蛋白质某个表位的抗体，且这个表位不会被任何其他蛋白质相互作用所掩盖，比普通WB抗体要求高出很多；同时，抗体特异性和灵敏性尽可能高，才有可能有干净的背景和较好的IP效果，所以必须选择最适合的抗体用于Co-IP实验。

【注意事项】

1、细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP-40 或 Triton- X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定；

2、不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂；

3、使用对照抗体：单克隆抗体：正常小鼠的 IgG 或另一类单抗;兔多克隆抗体：正常兔 IgG；

4、确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；

5、要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；

6、确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。

送检与交付标准

样品类型	样品需求	保存条件	运输条件	备注
动物组织	单个样品>0.1g，2mlEP管或冻存管装，不要过量；样本应尽量新鲜，如不能立即提取蛋白或核酸，应液氮速冻后冻存于-80℃或更低，冻存样本避免反复冻融以致降解	-80℃	干冰	所有样本均须有唯一标记，且标记清晰可识
种子样本	去壳新鲜或保存于液氮中的的种子样本，单个样品>0.2g。	-80℃	干冰
贴壁/悬浮细胞	1. 总RNA或蛋白：10⁶cell/指标、浆/核RNA或蛋白：10⁷cell/指标、线粒体RNA或蛋白：2*10⁷ cell/指标，样本尽量新鲜，细胞收取后直接加Trizol（QPCR检测）或直接冻存于-80℃ 2. 若细胞处理（加药、转染、感染）后状态差应酌情加大收样量	-80℃	干冰
全血/血清样品	用抗凝管保存的外周血 5~10ml，骨髓 1~3ml； -80℃保存不超半周的白细胞匀浆>400μl，每 400μl 加入 400μl Trizol。	-80℃	干冰
石蜡包埋样品	由标准的石蜡包埋盒包埋的石蜡块，有效厚度大于 0.1cm；新鲜的 FFPE 组织切片，每片厚度不超过 10μm，2~8 张，表面积不超过 250mm2。	-20℃	冰袋
抗体	1. 按样本种属提供满足相应实验要求的抗体； 2. 按抗体说明书要求寄送，尽量避免分装；如分装，确保量足够进行实验，并提供抗体说明书。 3.保存抗体的抗体管上应有能够识别此抗体的标记，抗体的量应大于实验所需的量。	-20℃	冰袋
引物	干粉，≥1OD，如进行预实验，每个基因至少提供两对引物，附带公司引物合成单。	-20℃	冰袋或常温

细胞交付标准.jpg