RNA pull-down

实验介绍

【技术原理】

首先标记 RNA（如生物素探针标记 RNA），将其与细胞裂解液共同孵育，形成 RNA-蛋白质复合物，分离复合物得到蛋白质，通过蛋白免疫印迹（western blot）或质谱（massspectrometry）检测蛋白。

【实验方法】

Step1：生物素探针标记RNA的制备

Step2：RNA抽提

Step3：细胞裂解

Step4：磁珠预处理

Step5：RNA与磁珠结合

Step6：RNA 与蛋白相互作用

Step7：蛋白的检测

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【实验流程】

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案例展示

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Samples were normalized by volume. L = lysate load; FT = flow-through, E = eluate.

【结果分析】

根据Western blotting检测结果可知带标记的AR 3´-UTR RNA可以特异性的结合HuR蛋白。

技术总结

【常见问题】

1、RNA结合蛋白没有结合

可能原因：（1）靶蛋白量不足；（2）缓冲体系不对；（3）RNA探针和蛋白的亲和力本来就低。

解决方法：（1）增加上样蛋白量；（2）应用低盐体系；（3）加入交联试剂。

2、RNA 降解

可能原因：无核酸酶的环境被破坏，比如RNA提取过程中的试剂及材料等；体外转录的RNA探针降解等。

解决方法：清洗和使用新开的离心管和试剂等；RNA探针合成后，电泳检测其长度和浓度。

3、RNA结合蛋白的亲和力不够

可能原因：结合缓冲环境没有优化、裂解不完全、磁珠用量不足、RNA探针用量不足等。

解决方法：优化孵育时间、温度、盐浓度等条件、增加裂解液和蛋白上样量的比例、适当改变磁珠及探针用量、增加裂解液、确定生物素和链霉亲和素效率等。

4、结合的非特异性高

可能原因：（1）缓冲环境没有优化；（2）缓冲环境严谨性低；（3）样品没有裂解完全和裂解体系没有优化。

解决方法：（1）优化孵育时间温度盐浓度等条件；（2）使用严谨性高的缓冲体系；（3）调低RNA探针和样品的比例；（4）提高裂解液的量。

5. WB信噪比高

可能原因：（1）阳性信号率低；（2）一抗效率低；（3）蛋白没有充分溶解。

解决方法：（1）增加二抗的量；（2）用敏感度的化学发光液；（3）用细胞裂解液预孵一抗；（4）增加样品的量；（5）确定有没有其他可能的结合情况；（6）增加裂解液用量。

【注意事项】

1、RIP反应体系中的试剂和抗体中均需保证无RNase；

2、磁珠与带标签的RNA要充分混合，可优化孵育的温度、时间以及RNA的含量等。

送检与交付标准

样品类型	样品需求	保存条件	运输条件	备注
动物组织	单个样品>0.1g，2mlEP管或冻存管装，不要过量；样本应尽量新鲜，如不能立即提取蛋白或核酸，应液氮速冻后冻存于-80℃或更低，冻存样本避免反复冻融以致降解	-80℃	干冰	所有样本均须有唯一标记，且标记清晰可识
种子样本	去壳新鲜或保存于液氮中的的种子样本，单个样品>0.2g。	-80℃	干冰
贴壁/悬浮细胞	1. 总RNA或蛋白：10⁶cell/指标、浆/核RNA或蛋白：10⁷cell/指标、线粒体RNA或蛋白：2*10⁷ cell/指标，样本尽量新鲜，细胞收取后直接加Trizol（QPCR检测）或直接冻存于-80℃ 2. 若细胞处理（加药、转染、感染）后状态差应酌情加大收样量	-80℃	干冰
全血/血清样品	用抗凝管保存的外周血 5~10ml，骨髓 1~3ml； -80℃保存不超半周的白细胞匀浆>400μl，每 400μl 加入 400μl Trizol。	-80℃	干冰
石蜡包埋样品	由标准的石蜡包埋盒包埋的石蜡块，有效厚度大于 0.1cm；新鲜的 FFPE 组织切片，每片厚度不超过 10μm，2~8 张，表面积不超过 250mm2。	-20℃	冰袋
抗体	1. 按样本种属提供满足相应实验要求的抗体； 2. 按抗体说明书要求寄送，尽量避免分装；如分装，确保量足够进行实验，并提供抗体说明书。 3.保存抗体的抗体管上应有能够识别此抗体的标记，抗体的量应大于实验所需的量。	-20℃	冰袋
引物	干粉，≥1OD，如进行预实验，每个基因至少提供两对引物，附带公司引物合成单。	-20℃	冰袋或常温

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